INCT - Resultados Obtidos

ENVELHECIMENTO E DOENÇAS GENÉTICAS: GENÔMICA E METAGENÔMICA

Nesse primeiro ano, período Julho /2017 – Junho/2018, dedicamo-nos mais a coleta
e dados e planejamento de experimentos que serão desenvolvidos nos próximos anos.
Os principais resultados obtidos no período são:

 

GENÔMICA

Variabilidade Genômica /Epigenômica e Longevidade  
Variabilidade Genômica 
 
Durante o período, conseguimos sequenciar  os genomas completos (Whole Genome Sequencing - WGS) de 1324 idosos (pessoas com mais de 60 anos) em colaboração com o Human Longevity Inc (S. Diego). Trata-se da maior base de dados da América Latina, com mais de 100 milhões de variantes genômicas e que vem abrindo portas para várias colaborações.A primeira etapa do estudo incluiu a publicação de uma base de dados, lançada em uma publicação com um número considerável de citações em curto período (Naslavsky, Yamamoto et al, 2017). A continuidade das análises e colaborações decorrentes dos dados genômicos fornecerá dados para estudos de alto impacto. Esse trabalho está sendo desenvolvido por Michel Naslavsky, Guilherme Yamamoto  e vários alunos de pós-graduação. 
 
Além disso, o grupo de pesquisa da Universidade Estadual da Paraíba, coordenado pela Profa. Dra. Silvana Santos, escolheu a cidade de Brejo dos Santos, no sertão da Paraíba, para iniciar um estudo de coorte envolvendo idosos com 65 ou mais. Nesta comunidade, a prevalência de casamentos consanguíneos é de 18%. Com a parceria das equipes da Estratégia Saúde da Família, foram realizadas entrevistas estruturadas com 180 idosos com 80 anos ou mais com uso do instrumento de coletada de dados do Estudo SABE (Saúde, Bem Estar e Envelhecimento), assim como a coleta de material biológico para realização de exames bioquímicos e estudo genético. Os dados foram consolidados por dois pesquisadores de forma independentes e constituído o banco de dados em Epidata, seguindo orientação da Profa. Dra. Yeda Duarte.
 
Atualmente, os dados estão sendo analisados para composição das primeiras publicações focando na descrição do perfil epidemiológico dessa população. Dos 179 idosos com 80 anos ou mais, foram selecionados 80 para genotipagem utilizando microarranjos (SNPs). Os dados genéticos serão analisados para avaliação do coeficiente de endocruzamento da população, para estudos de ancestralidade e para determinação do número de indivíduos que deve ser utilizado para análise de Exoma. Após análise das estratégias metodológicas e resultados preliminares desse estudo com o segmento de 80 ou mais é que serão definidas as etapas seguintes do projeto. Participam deste subprojeto cinco estudantes em nível de mestrado vinculados ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Pública, dois estudantes de iniciação científica e um estudante em nível de pós-doutorado. 
 
 
AbraOM: Arquivo Brasileiro Online de Mutações 
 
Os brasileiros, em particular os residentes da cidade de São Paulo, compõem uma população com alto grau de miscigenação com ancestralidades ameríndias, africanas, europeias e asiáticas, sub-representados nos bancos de dados genômicos. Este artigo apresenta a coleção de variantes exômicas de 609 brasileiros idosos de uma coorte (SABE609) baseada no censo da cidade de São Paulo, os quais foram também extensivamente fenotipados. As variantes foram depositadas no ABraOM (Arquivo Brasileiro Online de Mutações), uma base de dados pública e online. Repositórios de genótipos e fenótipos representativos de uma população são essenciais para a interpretação de variantes através da filtragem por frequências alélicas. Uma vez que a probabilidade de encontramos mutações patogênicas causais de doenças monogênicas de início na infância e vida adulta está diminuida nos idosos, tais bases de dados tornam-se altamente relevantes. Dentre as mais de 2,3 milhões de variantes presentes na coorte, 1.282.008 são consideradas confiáveis por parâmetros estritos de bioinformática. Dentre estas, 207.621 estão ausentes nos principais bancos de dados públicos. Encontramos 9.791 variantes com potencial perda de função sendo  aproximadamente 300 por indivíduo. Variantes patogênicas em genes clinicamente relevantes segundo critérios da sociedade American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) foram observadas em 1,15% dos indivíduos e correlacionadas com fenótipos clínicos. Foram estimadas a incidência para doenças recessivas prevalentes baseado na frequência de heterozigotos e concluímos que esta análise depende criticamente da classificação de patogenicidade. Estas observações ilustram a relevância de coletar dados demográficos de uma população com alta diversidade e pouco caracterizada. Bases de dados de indivíduos idosos e amostrados do censo com um repertório de fenótipos constituem um recurso inestimável para compreendermos a patogenicidade de variantes. É importante salientar que essa base de dados está disponível para todos os pesquisadores. Essa pesquisa foi realizada por Michel Naslavsky, Guilherme Yamamoto (supervisão Mayana Zatz e Maria Rita Passos-Bueno)
 
 
Associação de Diabetes e Doença de Alzheimer em idosos
 
A associação entre diabetes e doença de Alzheimer (DA) é pouco conhecida nos países menos desenvolvidos. Portanto, o objetivo desse trabalho foi de investigar a associação entre diabetes e DA em uma amostra grande de autopsias provenientes de idosos brasileiros. Os resultados mostraram que dentre 1037 amostras estudadas (idade média  = 74.4±11.5 y; anos de educação  = 4.0±3.7 y; 48% do sexo masculino, 61% caucasianos) 279 tiveram diabetes. 
 
A pesquisa não mostrou associação entre diabetes e neuropatologia compatível com DA nesta amostra de brasileiros idosos. Entretanto, confirmou-se que alguns sub-grupos como os portadores do alelo APOE ɛ4 tem uma maior probabilidade de acumular neurofibrilas Essa pesquisa em colaboração com a equipe do banco de cérebros da FMUSP  e CEGH-CEL foi  publicada  na revista J. Alzheimer Dis (Dos Santos Matioli , 2017).
 
 
 
Câncer mutations in healthy admixed elderly: can we improve pathogenicity interpretation?
 
Diversos países iniciaram projetos de sequenciamento completo do genoma (WGS) de suas populações, com dezenas a centenas de milhares de indivíduos estudados sem uma avaliação clínica a priori. Estas iniciativas contribuem com descobertas de novos mecanismos biológicos, mapeam a ancestralidade e auxiliam a modelagem da história evolutiva, mas a capacidade de tornar tais resultados acionáveis para a saúde pública e aplicável para a medicina ainda é limitada. Achados incidentais em pacientes não diagnosticados ou controles normais são desafiadores, uma vez que muitos projetos populacionais de grande porte tem dados fenotípicos e clínicos limitados; há também obstáculos para monitorar a saúde dos participantes, bem como localizá-los e fornecer o suporte necessário para lidar com a informação genética. A socidade American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) recomenda  recontatar os indivíduos sequenciados com  variantes patogênicas em genes específicos com acionabilidade clínica. Mutações germinativas em BRCA1 e BRCA2 são comumente associadas à suscetibilidade familal ao câncer de mama e ovário, e alterações nos genes envolvidos no sistema de reparo de DNA (MMR) – MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 estão associadas ao câncer colorretal hereditário não poliposo (HNPCC), uma síndrome de predisposição tumoral multissistêmica. Analisamos as variantes nestes 6 genes na coorte de idosos (60 anos e mais) da cidade de São Paulo (n=1324) que realizaram WGS. Entre as mais de 12 mil variantes nestes genes, 577 tem alterações em regiões codificadoras ou em sítios de splicing, dentre as quais 35 com potencial perda de função. Ao filtrar a classificação de patogenicidade do banco de dados ClinVar, identificou-se 9 variantes (das quais 7 são curadas) em 10 indivíduos com frequência populacional menor que 0.02% (gnomAD). Entre os indivíduos, seis são assintomáticos incluindo uma voluntária do sexo  feminino aos 93 anos,  portadora do códon de parada prematuro pQ563X em BRCA1 sem história familial de câncer. Outro participante com uma deleção com perda de quadro  de  leitura em BRCA2 reportou câncer de  pulmão.  Os dez indivíduos são  miscigenados, sendo 7  não-europeus  (<70% de ancestralidade europeia).  Esses  resultados  preliminares   ( submetidos ao Congresso da ASHG em S. Diego, outubro de 2018) sugerem que dados genômicos e clínicos de idosos são importantes para melhorar a interpretação de patogenicidade de variantes e estimativas  de risco  para aconselhamento  genético. Adicionalmente, dados de indivíduos miscigenados podem fornecer evidências para explicar a penetrância reduzida e levar à identificação de genes modificadores específicos da população para câncer ou outras doenças genéticas. Essa pesquisa foi realizada por Michel Naslavsky, Guilherme Yamamoto (supervisão Mayana Zatz e Maria Rita Passos-Bueno)
 
 
 
Bases moleculares da calcificação no cérebro do idoso 
 
A  medida que os diferentes exames de neuroimagem se tornaram mais acessíveis,  as calcificações cerebrais são cada vez mais identificadas  nos serviços de saúde. A prevalência é variável, afetando cerca de 1% da população adulta jovem até mais de 20% dos idosos. 
O envelhecimento e o histórico familiar são os dois  fatores de risco mais importantes para esta condição, ainda sub-diagnosticada, e clinicamente heterogênea, podendo se manifestar de forma muito semelhante a outras doenças, como mal de Parkinson, esquizofrenia, transtorno bipolar e quadros demenciais. 
 
O grupo coordenado por João Ricardo de Oliveira (Universidade Federal de Pernambuco) em colaboração com o CEGH-CEL,  se concentrou neste tema e avançou rapidamente no entendimento desta condição, tanto em pacientes como em modelos animais.
Mostrou-se que outros tecidos podem ser afetados e através de microscopia eletrônica, que as calcificações podem ser detectadas em análises de pele  de pacientes com mutações nos genes pdgfrb e xpr1, importantes para a manutenção da barreira hemato-encefálica e para o transporte de fosfato inorgânico para fora da célula.
 
Ainda em pacientes, mostramos que as alterações de expressão de alguns dos genes mutados podem ser detectadas em amostras de sangue, abrindo um novo horizonte para testes mais rápidos e baratos e que prescindam de uso de sequenciamento.
Em outro estudo em modelo celular, iniciou-se  a triagem de micro-RNAs que possam interferir na regulação do SLC20A2, o principal gene causador de formas familiares de calcificações cerebrais primárias. Essa primeira investigação mostra o Mir-9 como importante regulador do SLC20A2, em modelos de células HEK-293.
 
Já nos modelos animais, os achados em camundongos nocaute para os genes SLC20A2 e PDGFB foram confirmados e ampliados , dando suporte para uma caracterização fenotípica e longitudinal, através do estudo de animais em diferentes idades, confirmando o progresso temporal e a semelhança do modelo com o fenômeno que acomete humanos. Com isso, reforçou-se a possibilidade e a utilidade  de ter alguns modelos representativos da doença, imprescindíveis para a descoberta de novos tratamentos.
 
Avançar no entendimento das bases moleculares das calcificações cerebrais de herança genética mendeliana é fundamental  para entender o papel  das calcificações cerebrais que surgem com o envelhecimento. Já há uma mudança de paradigmas quando vemos que mesmo calcificações tidas como "benignas" por serem associadas ao envelhecimento, como as calcificações de plexo coróide e glândula pineal, são atualmente consideradas  como fator de pior prognóstico quando associados à doença de Alzheimer.
 
 
 
Variantes patogênicas e envelhecimento 
Variações no genoma não-codificador e desenvolvimento de tumores malignos do sistema nervoso central 
 
Nossos estudos demonstraram que a expressão aberrante de fatores de pluripotência aumenta a agressividade de tumores malignos do sistema nervosa central (SNC), realçando nesses tumores propriedades de células-tronco cancerosas, como maior tumorigenicidade e capacidade de metastatização, e resistência a agentes quimioterápicos. Verificou-se que esses efeitos envolvem a ação de diferentes tipos de RNAs não codificadores, incluindo-se microRNAs (miRNAs), long non-coding RNAs (lncRNAs) e small nucleolar RNAs (snRNAs) (Silva et al. 2017). Dois estudos funcionais estão em andamento para caracterizar a relevância de alguns desses RNAs. O estudo com o miRNA-367 verificou que o mesmo atua diretamente sobre a proliferação, resistência a morte celular, capacidade de geração de esferas tumorais e tumorigenicidade in vivo no SNC, e que sua ação envolve a regulação de uma proteína pertencente ao complexo de remodelamento da cromatina PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2). Em outro estudo envolvendo modelo com células-tronco embrionárias, verificou-se que o lncRNA SNHG6 regula neurogênese atuando sobre o miRNA-124. Manuscritos sobre os dois respectivos estudos estão em elaboração para submissão para publicação. Em paralelo, estudos com células-tronco mesenquimais (Gomes et al. 2017; Rodini et al. 2018) e pericitos (Ribeiro et al. 2017) verificaram que essas células possuem a capacidade de atuar no nicho tumoral e afetar positivamente o desenvolvimento de tumores, efeito a ser considerado quando da elaboração de protocolos de terapia celular vislumbrando o emprego desses dois tipos de células. 
 
Finalmente, utilizando células iPS como modelo experimental, demonstramos que  astrócitos de indivíduos com Síndrome de Down expressam níveis elevados de Wnt3 e Wnt3a, reguladores da via mTOR, e causam anormalidades neuronais (Araujo et al. 2018). Essa pesquisa foi realizada pelo aluno de pos-doc Bruno Araujo supervisionado   pelo Prof. Esper Cavalheiro.
 
Mais recentemente, em uma pesquisa de alto impacto,  demonstramos que células-tronco tumorais de SNC com via Wnt hiperativada são altamente susceptíveis a efeitos oncolíticos do vírus Zika (Kaid et al. 2018). Nesse último trabalho, destacado na capa da edição de 16 de Julho da revista Cancer Research, reportou-se pela primeira vez a capacidade do Zika em destruir tumores humanos do SNC e inibir a ocorrência de metástases in vivo. Essa pesquisa contou com vários alunos (supervisão Oswaldo Keith Okamoto e Mayana Zatz). 
 
Essa pesquisa foi possível graças ao conhecimento adquirido com o trabalho anterior realizado com gêmeos dizigóticos discordantes quanto a síndrome da zika congênita  e que teve grande repercussão internacional.  (Caires et al., 2018). Nessa pesquisa mostramos que a síndrome da zika congênita não é um evento stocástico mas depende de uma maior susceptibilidade genética nos bebês que foram afetados pela síndrome. Para chegarmos a essa conclusão derivamos células neuroprogenitoras (NPCs) a partir de células IPS de 3 pares de gêmeos discordantes( um afetado e um normal). Essas células NPCs foram infectadas “in vitro” com o vírus da zika. Observamos que as células NPCs obtidas dos gêmeos afetados eram muito mais suscetíveis à destruição  pelo vírus do que as linhagens derivadas dos bebês normais, reproduzindo “in vitro” o que observamos “in vivo”. Essas observações foram fundamentais  porque abriram o caminho para as pesquisas mostrando o potencial  oncolítico do virus da zika em tumores do SNC.  Essa pesquisa contou com vários alunos e colaboradores (supervisão Mayana Zatz)
 
 
 

METAGENÔMICA

Microbioma, envelhecimento e Genética 
 
Trabalhos recentes mostraram que a troca de sangue entre camundongos idosos e jovens (parabiose) rejuvenesceu os camundongos idosos. (Hofmann, 2018; Khoury & Ghossoub, 2018). A pergunta que queremos responder é se a troca de microbiota entre animais velhos e jovens também teria um efeito rejuvenescedor e aumento de longevidade. Além disso, vamos investigar o perfil metagenômico dos animais tratados em comparação com o grupo controle. 
 
Para isso estamos transferindo a microbiota (obtida de fezes) de camundongos jovens para camundongos idosos após tratamento com antibióticos visando destruir sua própria microbiota intestinal. Essa pesquisa está sendo realizada pela pós-doutoranda Heloisa Maria de Siqueira Bueno  e os animais estão em seguimento.(supervisão Mayana Zatz) 
 
Além disso, a partir do estudo de trigêmeos,  queremos entender melhor o  papel da variabilidade genética do hospedeiro na diversidade de microbiomas. Esse  projeto tem por objetivo expandir os conhecimentos acerca da interação entre hospedeiros e microbiomas e suas associações fenotípicas, visando elucidar o papel e importância quanto às influências genéticas e epigenéticas na formação e estabelecimento da microbiota intestinal. Trabalhos anteriores comparando gêmeos monozigóticos (MZ) e dizigóticos (DZ) foram realizados com adultos e portanto já submetidos a ambientes diversos.
 
No presente projeto, realizado pela aluna de pós-doutorado Larissa Matos, (supervisão Mayana Zatz) estamos selecionando trigêmeos resultantes de fertilização “in vitro” onde foram implantados dois embriões e um deles se dividiu posteriormente. Isto é, tem-se na mesma gestação dois gêmeos  MZ  e um DZ, submetidos as mesmas condições ambientais. A proposta é a de comparar a microbiota intestinal desses trigêmeos acompanhados por pelo menos um ano. Se a microbiota depender do ambiente espera-se que os três tenham um perfil muito semelhante, mas se depender de genética os gêmeos MZ devem ser mais concordantes do que o gêmeo DZ.
 
 O projeto ainda encontra-se em fase de padronização da coleta (uso de tubos coletores universais ou tubos estabilizantes), armazenamento da amostra (4°C, -20°C e -80°C) e melhor método de extração de DNA.
 
Até o presente momento, o projeto conta com a colaboração de 5 mães de trigêmeos (2 monozigóticos e 1 fraterno), totalizando 15 crianças, comprometidas com doação de amostras de microbiota intestinal (fezes) para sequenciamento e caracterização dos tipos bacterianos presentes nas amostras, através da análise metagenômica (Neoprospecta Microbiome Technologies – Florianópolis, SC). 
 
 
Microbioma, microbioma materno- fetal e epigenética  
Analise de epigenética em  fissura lábio-palatina não  sindrômica (FLP-NS): 
 
Com o intuito de compreender e responder se fatores epigenéticos estão associados às fissuras lábio-palatinas não sindrômicas (FL/P NS), nós realizamos um estudo de associação epigenômica em amostras FL/P NS e controles em que optamos pela análise de metilomas e, portanto, de diferenças de metilação. Utilizando-se a plataforma Infinium Human Methylation 450K Illumina, comparamos os metilomas de 67 pacientes FL/P NS e 59 controles (em ambos os grupos foram utilizadas amostras de DNA de sangue periférico e os grupos foram pareados por idade e sexo). Com a análise diferencial de metilação, encontramos 578 sítios diferencialmente metilados entre os grupos (MVPs – methylation variable positions), os quais estão enriquecidos em regiões regulatórias como promotores e enhancers, o que suporta a funcionalidade dessas diferenças. Também, a análise de vias canônicas revelou que estes MVPs estão enriquecidos nas vias “Regulação da Transição Epitélio Mesenquimal” e via “WNT-Beta Catenina”, vias já associadas e importantes ao desenvolvimento craniofacial. Os resultados foram validados em uma nova coorte de 171 FL/P NS e 177 controles (coorte inglesa, amostras de DNA de sangue periférico e pareadas por idade e sexo). Ainda, demonstramos que os níveis de metilação do promotor do CDH1 estavam significativamente maiores nos indivíduos com FLP e mutação CDH1 (penetrantes) em relação aos não penetrantes e controles (p< 0.05). Desta forma, nossa hipótese é que a metilação de DNA pode atuar como segundo hit para a penetrância do fenótipo. Estes resultados foram publicados na Scientific Reports-Nature em 2017 (Alvizi, L et al, 2017. Differential methylation is associated with non-syndromic cleft lip and palate and contributes to penetrance effects. Scientific Reports).  Estamos dando continuidade a esse projeto, onde iremos testar o papel da ativação inflamatória em embriões de zebrafish com mutação no cdh1 durantes as fases do desenvolvimento craniofacial. (supervisão Maria Rita Passos-Bueno)
 
Analise do microbioma em mães de indivíduos com FLP-NS:
Nesse projeto,  propusemos a investigação do microbioma da cavidade oral de mães que tiveram bebês com FLP-NS,  a fins de testarmos a hipótese de que o microbioma oral de mães de crianças FLP-NS é distinto do microbioma de mães de crianças não afetadas e de que tal microbioma teria implicações em respostas imunes, o que por sua vez pode levar   a mudanças epigenéticas nos embriões contribuindo então  para a origem da FLP-NS. Para isso, iremos sequenciar o 16S rRNA de todo microbioma presente na saliva de mães de crianças com FLP-NS e compará-lo com o microbioma de mães de crianças sem FLP-NS. Até o momento, foram coletadas 125 amostras, sendo 99 amostras de mães de FLP-NS e 26 amostras de mães controle. Em 41 dessas amostras (31 mães FLP-NS e 10 mães controles), também realizamos a análise odontológica para caracterização da higiene bucal do indivíduo. Indivíduos que possuíam alguma alteração de gengiva, do grau mais leve – gengivite - ao mais grave - periodontite, foram classificados como “Não Hígido” (NH), os que possuíam gengiva hígida e nenhuma cárie foram classificados como “Hígido” (H). Destas, foram selecionadas e sequenciadas 12 amostras para um estudo piloto, 6 mães controles e 6 mães FLP-NS e em cada grupo 3 amostras H e 3 amostras NH. As análises iniciais demonstraram que há diferença significativa na alfa diversidade entre as amostras classificadas como NH e H independente de ser mães controle ou mães FLP-NS (P= 0,038).  Como a saúde bucal pode ser um fator de confusão dos dados, no momento estamos estabelecendo  uma nova parceria para ampliarmos o numero de controles  com avaliação odontológica. Nossa meta será ter 30 amostras de cada grupo (30 controles e 30 FLP-NS) para uma primeira análise (supervisão Maria Rita Passos-Bueno)
 
 
 

ANÁLISE FUNCIONAL

Células pluripotentes induzidas e envelhecimento Sinalizacão mTOR  
 
Diversos estudos recentes têm mostrado que inibidores da via de sinalização mTORC1, como a rapamicina, constituem agentes farmacológicos promissores para retardar a senescência de vários tipos de células. Neste projeto, coordenado pela pesquisadora Andrea Sertié, utilizando como modelo experimental células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de doares sadios (bone marrow MSCs, BM-MSCs), objetivamos explorar mecanismos moleculares pelos quais a rapamicina aumenta a longevidade celular. Para isso, BM-MSCs derivadas de 5 doares jovens e saudáveis (3 homens e 2 mulheres, idade 30-39 anos) foram sucessivamente repicadas na ausência ou na presença contínua de rapamicina (20nM) até atingirem a senescência (parada do ciclo celular), e no número acumulado de duplicações da população de células foi medido para cada amostra. A inibição da atividade da via mTORC1 foi avaliada pela quantificação de fosforilação da proteína RPS6, dowstream a mTORC1, por western blot. Os níveis de expressão de vários marcadores de senescência (proteínas citoplasmáticas p16-INK4A, p21-WAF1, pRPS6 e SOD2; citocinas pro-inflamatórias constituintes do “fenótipo secretor associado a senescência” IL6 e IL8) e pluripotência (genes NANOG, SOX2 and OCT4) em passagens precoces e tardias/senescentes foram analisados por RT-qPCR, citometria de fluxo e western blot. Observamos que a extensão da vida replicativa das BM-MSCs em resposta ao tratamento contínuo com rapamicina foi altamente variável entre as amostras, mas eficaz na maioria delas. Apesar de todas as células tratadas com rapamicina secretarem níveis significativamente menores de IL6, uma das principais citocinas do fenótipo secretor associado a senescência, e expressarem níveis significativamente mais altos do marcador de pluripotência NANOG, os padrões de expressão desses marcadores não foram correlacionados com o aumento da longevidade celular mediado pela rapamicina. De forma interessante, a extensão da longevidade das BM-MSCs mediada pela rapamicina foi significativamente associada à repressão do acúmulo de proteína p16-INK4A (r=-1.0, p=0.016) em vez da repressão de seus níveis de mRNA. Em conclusão, nossos resultados sugerem que algumas, mas não todas, amostras de BM-MSC se beneficiariam do uso da rapamicina para adiar a parada replicativa e revelam um papel crítico da regulação negativa da proteína p16-INK4A, um inibidor de quinase dependente de ciclina que regula negativamente a progressão do ciclo celular inibindo a transição da fase G1 para a fase S, nesse processo.
O artigo com os resultados inéditos deste trabalho foi recentemente submetido para publicação (supervisão Andrea Sertié e Maria Rita Passos-Bueno).
 
 
Mitocondria e  autofagia em neurônios dopaminérgicos (normais  e em Mal de Parkinson) 
 
A mobilidade mitocondrial e a densidade dos autofagossomos foram analisadas em neurônios dopaminérgicos derivados de células iPS de paciente com doença de Parkinson associada a triplicação do gene SNCA, utilizando-se mito- e liso-tracker. Foi observado que o tráfego mitocondrial está diminuído nos neurônios maduros que superexpressam a alfa-sinucleína em relação àqueles dos controles. O experimento com lisotracker mostrou que os autofagossomos estão acumulados principalmente no corpo celular desses neurônios derivados de paciente com DP. Os resultados dessa pesquisa, coordenados pela Prof. Merari Ferrari,  sugerem que o aumento dos níveis da alfa-sinucleína leva ao distúrbio do tráfego mitocondrial e da autofagia antes mesmo da formação dos agregados proteicos.
 
 
Doenças raras monogênicas de envelhecimento precoce  
 
Algumas síndromes genéticas monogênicas apresentam fenótipos considerados progeróides, ou seja, desenvolvem precocemente características clínicas semelhantes às observadas no envelhecimento humano normal. A relação fisiopatológica entre essas doenças e o processo de envelhecimento vem sendo estudada, sendo que o entendimento dos mecanismos moleculares em um campo contribui para a compreensão do outro. As síndromes de Hutchinson-Gilford (SHG) e Rothmund-Thomson (SRT) são duas condições progeróides raras, já bem caracterizadas clinicamente, que são causadas por alterações nos genes LMNA (mutação em um alelo) e RECQL4 (mutação nos dois alelos), respectivamente. No entanto, em cerca de 40% a 60% dos indivíduos com a síndrome de Rothmund-Thomson, não são encontradas mutações em RECQL4, constituindo um subgrupo chamado de tipo I; desse modo, os casos com alteração no gene constituem o tipo II da síndrome. Indivíduos com o tipo II apresentam um risco aumentado para o desenvolvimento de câncer, particularmente o osteossarcoma. Uma síndrome com características progeróides precoces, com alta letalidade, denominada síndrome progeróide neonatal ou síndrome de Wiedemann-Rautenstrauch (SWR), com um padrão de herança autossômico recessivo, teve sua base molecular recentemente descrita (dezembro de 2016) em um único paciente. 
 
Neste período foram avaliados dez indivíduos: um com o diagnóstico da SHG, um com SWR e oito com diagnóstico da SRT.  O estudo molecular realizado permitiu a confirmação da hipótese clínica no paciente com a SHG ou progéria e em 3/8 (37,5%) dos pacientes com a SRT. Embora tenha-se empregado a técnica do sequenciamento do exoma completo na tentativa de se identificar a base molecular nos pacientes com a SRT tipo I, não foi possível identificar variantes em um mesmo gene nestes pacientes. Desta forma, é possível que variantes intrônicas ou em regiões regulatórias, não cobertas pelo exoma sejam responsáveis pela SRT tipo I e pesquisa será continuada.
 
No caso da SWR, apenas uma variante exônica no gene POLR3A foi encontrada. O fato de não haver consanguinidade na família sugere que a paciente seja heterozigota composta e a técnica empregada não permitiu identificar a segunda variante.  (Pesquisa supervisionada por Debora Bertola e Guilherme Yamamoto). 
 
 
 
Analise de VAP-B  em IPSc e neuronios motores de pacientes  com esclerose lateral amiotrofica (ELA) e familiares
  
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa grave, cuja incidência estimada é de cerca de 2:100000 indivíduos, e que caracteriza-se primariamente pela morte seletiva de neurônios motores superiores e inferiores.  Pacientes afetados por essa enfermidade tipicamente apresentam uma fraqueza muscular excessiva e fasciculações, que evoluem ao ponto de causar a perda da capacidade de ambulatória e atrofia muscular. Tais comprometimentos motores progridem, levando-os a óbito, na maioria dos casos por perda da capacidade respiratória, cerca de 3 a 5 anos do início dos sintomas. O presente projeto tem por objetivo o estudo de uma forma familial dessa enfermidade (ELA8) causada por uma mutação de ponto no gene vesicle trafficking protein B (VAPB P56S). Semelhantemente aos outros subtipos de esclerose lateral amiotrófica, a ELA8 apresenta uma variabilidade fenotípica considerável, com alguns pacientes possuindo um curso clinico típico, com o início por volta dos 50 anos de idade e já incapazes de deambular e dependentes de auxílio para respirar após cerca de 10 anos de progressão, enquanto outros permanecem capazes de caminhar e assintomáticos até os 70 anos de idade. Tal discrepância leva à hipótese de que fatores moduladores possam estar interferindo na velocidade da progressão da doença. Nesse sentido, e com o objetivo de testar essa hipótese, linhagens de iPSCs (induced pluripotent stem cells) de três controles da família (dois homens e uma mulher), três pacientes graves (com comprometimento grave após cerca de 10 anos de progressão e com início entre 40 ~50 anos, dois homens e uma mulher) e dois pacientes com um curso clínico leve (uma mulher com 70 anos e ainda capaz de caminhar e um homem com ~75 anos e que se movimenta com ajuda de bengala) foram geradas, caracterizadas para a expressão de marcadores de pluripotência e avaliadas para a integridade do seu cariótipo através do MLPA (multiplex ligation probe amplification). Um protocolo novo de diferenciação de neurônios motores (NMs) foi padronizado para esse projeto e, em seguida, NMs foram derivadas a partir das iPSCs. RNA total foi extraído e utilizado para experimentos de RNA sequencing em colaboração com o Prof. Sergio Verjovski-Almeida do Instituto Butantan.  Esse projeto realizado pelo aluno de doutorado Danyllo Oliveira (orientação MZ) espera, portanto, identificar mecanismos/ genes moduladores da degeneração neuronal em ELA8 e partir dessa informação, abrir caminhos para intervenções terapêuticas. 
 
Além disso, publicamos recentemente um trabalho (Coatti et al., 2017) onde mostramos em linhagens de NMs em  outra forma de ELA hereditária (causada por mutações no gene  FUS)  quando co-cultivadas com pericitos induziram a expressão de enzimas antioxidantes. Esses resultados sugerem um efeito benéfico dos pericitos sugerindo uma possível aplicação terapêutica. 
 
 
Uso de doenças genéticas para melhor compreender envelhecimento muscular 
Populações de células musculares satélites: envelhecimento e correlação com processo  distrófico 
 
Em doenças caracterizadas por processo de degeneração crônica, como distrofias musculares, as SCs são constantemente ativadas, e esta condição pode levar à depleção do pool de SCs e consequente falha no processo regenerativo. Nós estudamos as SCs musculares nas linhagens distróficas murinas DMDmdx, Largemyd, DMDmdx/Largemyd, em comparação a camundongos normais, com o principal objetivo de avaliar o comportamento das SCs em músculos distróficos com diferentes graus de degeneração histopatológica. A expressão de genes e proteínas de fatores de transcrição relacionados a SCs foram estudadas no músculo, e os resultados foram comparados com as características histopatológicas de regeneração e degeneração e estado de proliferação de células musculares. Nossos resultados mostraram que o músculo distrófico mantém seu pool de células satélites, expressando PAX7, um importante fator muscular para autorrenovação do pool de SCs, em níveis semelhantes em todas as linhagens distróficas e controle normal. As células isoladas de músculo distrófico apresentaram uma maior proporção de células em proliferação, com maior número de células na fase G2/M. A cascata de genes de regeneração é ativada no músculo distrófico, com altos níveis de expressão de fatores de regeneração muscular, como MYOD e Myogenin. O músculo distrófico mantém a capacidade de formar novas fibras, observada por um número significativo de fibras recém-formadas, que expressam dMHC, em todas as linhagens analisadas. No entanto, essas novas fibras mostram características de maturação incompleta, como tamanho pequeno e pouca variação em seu calibre, que pode ser determinante para sua disfunção. A degeneração muscular é intensa apesar da regeneração, com infiltração significativa de tecido conjuntivo em camundongos distróficos. Em conclusão, nossos achados sugerem que os músculos distróficos, independentemente do grau de degeneração, mantêm o pool de células satélites com capacidade proliferativa e estão prontos para responder aos estímulos regenerativos. Por outro lado, a maturação dessas novas fibras é incompleta e não previne a degeneração do músculo.  (O trabalho já foi submetido para publicação.  (Dissertação de mestrado de Antonio F. Ribeiro Junior, orientação Mariz Vainzof)
 
 
Em busca de micropartículas com alto potencial miogênico para regeneração muscular 
 
Estamos testando qual tipo de célula-tronco produziria vesículas extracelulares contendo as melhores informações para desenvolver o  potencial regenerativo muscular. Inicialmente, utilizamos EVs isolados de células C2C12, devido à sua boa capacidade de proliferação e diferenciação muscular. AS EVs extraídos foram marcados com um corante verde e co-cultivadas  com mioblastos C2C12, bem como com  fibroblastos murinos. Os Fibroblastos de co-culturas foram capazes de se  fundir e expressar marcadores miogênicos, sugerindo uma transdiferenciação induzida por células musculares EVs.
 
Para os estudos in vivo, as EVs foram injetados diretamente no músculo gastrocnêmio de camundongos normais (C57black) e distróficos (Dmdmdx e Largemyd), e os músculos foram analisados após 2 e 10 dias. A detecção de corante verde por FACS foi feita em músculos dissociados, e a incorporação de EVs foi observada em todos os músculos, independentemente do grau de degeneração muscular. A fim de verificar se os EVs poderiam contribuir com o benefício funcional, outros animais foram injetados mensalmente com EVs, e as análises funcionais mostraram um aumento de força muscular nas linhagens distróficas.   Os resultados preliminares foram apresentados do Congresso Internacional da Sociedade de Músculo,  (Ayub et al., WMS 2016, supervisão Mariz Vainzof) e receberam um prêmio.