Informações gerais sobre fluorocromos, primers e marcadores de peso molecular

Fluorocromos e primers

Os primers devem ser marcados com o fluorocromo na extremidade 5’ (deve ser marcado somente um dos primers do par).

Uma alternativa econômica para quem quer usar vários marcadores é usar uma cauda de M13-fluorescente (Schuelke M., Nat Biotechnol. 2000 18:233-234).

O ABI3730 permite as seguintes combinações de fluorocromos:

1. Dye Set D – para combinação de primers marcados com 6-FAM, HEX, NED. 

O marcador de peso molecular utilizado é o GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems – cód. 401734).

2. Dye Set DS-33 – para combinação de primers marcados com 6-FAM, VIC, NED e PET.

O marcador de peso molecular compatível com este set é o GeneScan 500 Liz (Applied Biosystems – cód. 4322682).

 

Size Standard

Utilizamos o GeneScan 500 (Applied Biosystems – cód. 401734 – ROX ou cód. 4322682 – LIZ ) que possui fragmentos que variam de 35 a 500bp. Recomendamos que os fragmentos de PCR tenham no mínimo 70bp e no máximo 500bp, para garantir uma análise mais acurada.

O Size Standard é adicionado a cada um dos orifícios da placa de corrida, que corresponde a um capilar. O software usa o Size Standard para criar uma curva para cada capilar analisado, gerando uma análise individual e precisa.

 

Amostras (Produto de PCR)

A amostra de PCR precisa estar dessalinizada. Isso pode ser feito utilizando colunas para purificação de PCR (p.ex., illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit).

Para a maioria dos casos é suficiente apenas diluir a PCR em H2O ultrapura.

No geral, três a quatro PCRs diferentes podem ser misturadas para serem corridas num mesmo capilar, contanto que tenham sido marcadas com fluorocromos de cores diferentes (de preferência FAM, HEX e NED). Se tiverem a mesma cor, devem ter tamanhos diferentes.

É possível correr mais de quatro PCRs no mesmo capilar, mas o ideal é fazer um teste antes para verificar se as PCRs são limpas e não geram fragmentos inespecíficos que podem interferir na análise de outro marcador.