Informações técnicas sobre a plataforma HiSeq 2500

 

1. Especificações

O sistema HiSeq2500 é adequado para projetos que tenham necessidade de uma produção de grandes volumes de dados de sequenciamento em um curto período de tempo, a um custo reduzido. Ele apresenta dois modos de corrida (“Rapid Run” e “High Output Run”), além da capacidade de sequenciar uma ou duas lâminas (flow cells) simultaneamente. 
Para informações sobre qual tipo de corrida é mais adequada para seus experimentos, favor consultar o site da Illumina ou um de seus representantes (http://systems.illumina.com/systems/sequencing.html)

 

2. Princípios do Sequenciamento da Plataforma HiSeq 2500

Inicialmente o pesquisador prepara a biblioteca com suas amostras de acordo com as características do seu projeto. Uma lista com todos os kits comercializados, bem como suas aplicações, poder ser obtida no site da Illumina (http://systems.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500/kits.html).
 
No caso da Rapid Run, as bibliotecas (pool com as amostras) são injetadas em uma lâmina (flow cell) que possui 2 canaletas (lanes). Na flowcell existe uma superfície composta por óligos complementares aos adaptadores das bibliotecas. Essa lâmina é colocada no HiSeq 2500, onde ocorre a incorporação dos nucleotídeos marcados com fluorescência e sequenciamento por síntese base a base (SBS sequencing). Ao ocorrer a incorporação de um nucleotídeo, a fluorescência é excitada por uma série de lasers e captada por câmeras. Após a captura da imagem, inicia-se o próximo ciclo de incorporação. Ao final da corrida, prossegue-se com a análise bioinformática mais adequada ao projeto.

No modo High Output, as bibliotecas (pool com as amostras) são injetadas em uma lâmina (flow cell) com 8 canaletas (lanes) após clusterização em um robô chamado cBot (Illumina). No HiSeq 2500 se dá o sequenciamento pelo mesmo princípio descrito na Rapid Run.

 

3. Volume de dados gerados por corrida

A eficiência no número de dados gerados na plataforma HiSeq 2500 depende de uma série de fatores:

  • Tipo de sequenciamento escolhido: “paired-end reads” geram o dobro de dados, em comparação a “single-reads”;
  • Tamanho do fragmento: quanto maior o fragmento, menor a eficiência na geração de clusters e sequenciamento;
  • Qualidade da amostra: amostras degradadas podem impedir a produção de bibliotecas confiáveis, gerando baixa eficiência de sequenciamento e dados não representativos. Amostras com conteúdo GC muito baixo ou muito alto podem reduzir a eficiência do sequenciamento;
  • Qualidade da biblioteca produzida: a presença de dímeros de adaptadores e imprecisões na quantificação do material comprometem a eficiência do sequenciamento.

A quantidade ótima de dados gerados em uma corrida na plataforma HiSeq 2500 varia de acordo com os parâmetros selecionados para o sequenciamento. Dúvidas sobre qual a melhor forma de preparo das bibliotecas e qual a melhor forma para o melhor tipo de corrida de acordo com cada projeto, podem ser tiradas com os consultores dos fabricantes no momento da aquisição dos kits.

Informações mais detalhadas da plataforma HiSeq 2500, como utilizações e formas de preparo de bibliotecas de acordo com cada projeto, podem ser obtidas no site: http://systems.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500/system.ilmn ou com o consultor científico da Illumina no momento da aquisição dos kits. É importante salientar que, quando o pesquisador adquire os reagentes para a execução das bibliotecas e kits para corrida no HiSeq 2500, a Illumina oferece treinamento gratuito