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Protocolo de preparação da reação de sequenciamento para plasmídios — usuários da opção A

Os plasmídios devem ser purificados e quantificados como descrito em informações sobre qualidade e concentração das amostras e primers. 

Utilizar as seguintes quantidades de reagentes por reação:

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Mix – 2uL
BigDye® Terminator v3.1 5x Sequencing Buffer – 1uL
Primer 5uM – 1uL
Plasmídio – consultar gráficos abaixo *
H2O ultrapura – q.s.p. 10uL
Total = 10uL

* A quantidade de Plasmídio (em nanogramas) que deve ser adicionada à reação irá variar com o tamanho da sua amostra. Consulte o gráfico abaixo para verificar quantas nanogramas devem ser adicionadas à sua reação. Por exemplo, se seu plasmídio (vetor + inserto) tiver 4000bp você deverá colocar 200ng de plasmídio na reação de sequenciamento.

Ciclar utilizando o seguinte programa:

– 96°C por 1 minuto
– Repetir 25 ciclos de:
   • 96°C por 10 segundos
   • 50°C por 5 segundos
   • 60°C por 4 minutos
– 4°C – 

Observação: É muito importante que dos 96°C para os 50°C a rampa utilizada seja de 1°C/seg. Independente do primer a ser utilizado, a temperatura de annealing é sempre de 50°C.

A purificação pós reação deve ser feita por precipitação com Etanol/EDTA, Etanol/EDTA/Acetato de Sódio ou por colunas de purificação, conforme descrito no protocolo do BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. As amostras devem ser enviadas secas em tubos de 0,2mL ou placas de 96 seladas (embrulhar em papel alumínio para proteger da luz).